Evaluación comparativa de 2 ensayos clínicos para pruebas de enfermedades transmitidas por vectores en perros

Las enfermedades caninas transmitidas por vectores (CVBD), incluida la enfermedad de Lyme, la ehrlichiosis y la anaplasmosis, son cada vez más prevalentes a medida que la distribución de las garrapatas se expande a través del cambio climático, la migración de la vida silvestre y el aumento de la reubicación de animales de compañía en todo el mundo. Tanto los perros como los humanos son susceptibles a la transmisión por garrapatas de Borrelia burgdorferi, Anaplasma phagocytophilum, Anaplasma platys, Ehrlichia canis, Ehrlichia ewingii, Ehrlichia chaffeensis y transmisión por mosquitos de Dirofilaria immitis. Dado que muchos de estos organismos pueden causar enfermedades en perros y seres humanos, la detección exhaustiva de la exposición y/o la infección a los CVBD en perros es importante desde el punto de vista diagnóstico para los veterinarios y epidemiológicamente importante para la vigilancia de la salud pública y las intervenciones de control de vectores.

Las infecciones por E. canis en perros se diagnostican mediante la detección microscópica de mórulas en los monocitos circulantes o mediante la detección de anticuerpos agudos y convalecientes mediante un ensayo de inmunofluorescencia (IFA) o un ensayo de PCR. El IFA puede detectar anticuerpos cruzados y reactivos en muestras de perros expuestos a E. ewingii, E. chaffeensis y potencialmente otras Ehrlichia spp. El SNAP es la primera prueba rápida que incorporó la identificación de un péptido específico de E. ewingii para hacer detección de anticuerpos, así como para Ehrlichia spp. Los signos clínicos en los perros infectados con E. ewingii pueden ser similares a los de E. canis, como fiebre, letargo, anorexia, cojera (poliartritis) y, en algunos casos, trombocitopenia grave.

Así mismo, para el diagnóstico de A. phagocytophilum se puede identificar la mórula en el microscopio en fase aguda, o mediante la amplificación del DNA en PCR. Otros métodos diagnósticos, son la identificación de Ac. con Ag. bacterianos en ELISA o por la prueba de IFA. En el caso de A. platys, causa trombocitopenia cíclica, y generalmente hay coinfección con E. canis, generando cuadros clínicos más severos, debido a la garrapata Rhipicephalus sanguineus. 

La enfermedad de Lyme es causada por la B. burgdorferi, el cuadro clínico en perros se caracteriza por laminitis, anorexia y letargo. La detección de Ac para el péptido C6 mediante ELISA o IFA es considerado altamente específico de la infección natural, y no se encuentran en animales inmunizados con vacunas comerciales. 

El gusano del corazón es transmitido por mosquitos, su presentación clínica se caracteriza por letargo, tos e intolerancia al ejercicio, en caso dado de no ser tratada puede ser mortal. aunque también se pueden presentar casos subclínicos. 

La detección de CVBD y las coinfecciones en perros, es importante para los veterinarios, los animales, propietarios y la salud pública, ya que algunos de estos vectores pueden infectar de igual manera a humanos. El SNAP test de IDEXX, es una prueba rápida basada en la tecnología ELISA, que ha sido validada de manera masiva para la detección simultánea de Ac de A. phagocytophilum, A. platys, E. canis, E. ewingii, B. burgdorferi y Ag de D. immitis. El FLEX4 test de Abaxis, está comercialmente disponible para la detección de anticuerpos de patógenos transmitidos por vectores y antígeno de D. immitis en perros. No hay artículos publicados que comparen el comportamiento de estas 2 pruebas rápidas con un test de referencia o “Gold standard”. 

Materiales y métodos

Se identificaron un total de 844 muestras de suero o plasma para evaluación comparativa. Las muestras se almacenaron en un congelador a -20° C hasta que se analizaron.

Set de muestras para IFA – Ehrlichia canis; consistió en 68 muestras seroreactivas para IFA E. canis y 86 no seroreactivas enviados al laboratorio de referencia IDEXX, Westbrook, de las cuales 47 provenían de E.E.U.U. y 107 de Europa. Los títulos de los seroreactivos variaron entre 1:100 y > 3200, y se confirmaron mediante ELISA. Los perros incluidos en este conjunto de muestras se analizaron como un componente de la atención veterinaria de rutina a la sola discreción del veterinario tratante.

Los reactivos (péptidos o proteínas recombinantes) usados en estas pruebas de screening son molecularmente distintas a las utilizadas en el SNAP. Para este estudio los reactivos utilizados en el FLEX4 no han sido divulgados para permitir una evaluación similar.

Las muestras usadas para A. phagocytophilum y B. burgdorferi fueron remitidas al Laboratorio de referencia IDEXX, donde por medio de IFA se detectaron 71 muestras seroreactivas para A. phagocytophilum con títulos que varían entre 1:50 a > 3200, y los no seroactivos corresponden a 89 muestras. 

La identificación de B. burgdorferi se realizó utilizando el test OspA Line plus donde se evidenciaron 44 pacientes latentes a exposición y/o infectados, y 61 seronegativos por WB.

La identificación y confirmación de antígeno de D. immitis en 51 muestras se hizo mediante necropsia.

La comparación de la sensibilidad y especificidad de las pruebas SNAP y FLEX4, se realizó de manera aleatoria con muestras con etiqueta oculta de suero o plasma en cada test rápido. Las pruebas fueron realizadas y visualmente interpretadas por 3 diferentes operadores de acuerdo a las instrucciones de manufactura. Los resultados fueron comparados con el método de referencia para calcular sensibilidad y especificidad. 

Resultados

Sensibilidad y especificidad

Se analizaron un total de 844 muestras utilizando los ensayos SNAP 4Dx y FLEX 4. Ambos ensayos fueron leídos de forma independiente por 3 lectores. No se obtuvieron resultados de prueba “no válidos” con ninguno de los ensayos. Como se describe en los Métodos, todas las muestras fueron pre seleccionadas para esta evaluación según la ubicación geográfica y el ELISA de IFA, WB y / o especies específicas. Se utilizaron pruebas de necropsia y ELISA PetsChek para identificar muestras positivas y negativas al antígeno del gusano del corazón, respectivamente.

Discusión

La capacidad de un ensayo rápido en la clínica para detectar con precisión los anticuerpos contra un organismo o sus antígenos depende de varios factores. Los reactivos utilizados en los ensayos deben ser específicos del analito y deben tener una sensibilidad muy alta para la detección de anticuerpos o antígenos. Además, para los ensayos multiplex, los reactivos no deben reaccionar de forma cruzada ni interferir con los otros analitos utilizados en el mismo dispositivo.

En este estudio, se utilizaron como muestras de referencia para anticuerpos de A. phagocytophilum  determinados por IFA para comparar la sensibilidad y especificidad de las 2 pruebas, en donde el SNAP (84,5%) tuvo una sensibilidad mucho más alta que el FLEX4 (12,7%) para detección de estos anticuerpos. El FLEX4 también tuvo un comportamiento variable de acuerdo a las titulaciones IFA, indicando que en muestras de campo se obtendrán resultados falsos negativos en perros infectados o expuestos a A. phagocytophilum.

El método de referencia para A. platys fue el test de ELISA especie- específica, donde se usó un péptido diferente al p30 usado en el SNAP. El FLEX4 tuvo una sensibilidad de 33% comparado con el SNAP, indicando que generará más de 50% de resultados falsos negativos, limitando así su utilidad diagnóstica para Anaplasma spp. 

Comparado con el SNAP (95,5%), el FLEX4  (40%) tiene una sensibilidad menor para la detección de Ac. de B. burgdorferi en perros, llevando así a más del 50% de resultados falsos negativos como prueba de rutina. 

En este estudio, la sensibilidad de detección de Ac. E. canis en el SNAP es de 97,1%, lo que concuerda con estudios previos que reportan alta sensibilidad y especificidad; donde los 2 antígenos usados para detectar Ac. antiehrlichia en el SNAP son péptidos inmunodominantes derivados de proteínas de superficie caracterizadas para E. canis, E. chaffeensis y E. ewingii. De igual manera, la sensibilidad del SNAP fue mayor que el FLEX4 (61.4%), en donde 17 de 57 muestras con títulos de Ac. para E. canis >1:1280 resultaron falsos negativos.

Para  la detección de Ag. de D. immitis, en este estudio tanto el SNAP como el FLEX4 tuvieron una especificidad del 100%, sin embargo la sensibilidad del FLEX4 (88%) fue menor que en el SNAP (94%). Hay muchos factores que pueden afectar la exactitud diagnóstica en pruebas para el Ag. del gusano del corazón, tales como el número de gusanos, el género, y la presencia de formas inmaduras o agonizantes.

La habilidad de las pruebas rápidas y su exactitud para determinar la exposición o infección de 1 o más patógenos transmitidos por ectoparásitos es importantes para los veterinarios que evalúan perros con signos clínicos indicativos de CVBD, o para determinar coinfecciones que pueden requerir diferente manejo o tratamiento, y que hoy en día han aumentado su prevalencia. 

Conclusiones

La precisión de cualquier prueba en la clínica es de vital importancia para los veterinarios, las mascotas y los clientes al determinar la exposición o la infección con uno o más patógenos transmitidos por vectores. Basados en los resultados comparativos de este estudio, el SNAP es una prueba rápida más sensible que el FLEX4 en la detección de anticuerpos de A. phagocytophilum, A. platys, B. burgdorfri, E. canis, E. ewingii, E. chaffeensis y antígeno de gusano del corazón en perros. 

Tomado de:

  • Research Article:
  • Comparative Evaluation of 2 In-Clinic Assays for Vector-Borne Disease Testing in Dogs
  • Jiayou Liu, PhD, Jan Drexel, MS, Blaine Andrews, DV, Matt Eberts, DVM, Ed Breitschwerdt, DV, Ramaswamy Chandrashekar, MS,PhD.

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